Вокруг нас много незаметных героев, которые кажутся обычными, но на самом деле молча вносят огромный вклад в нашу жизнь. Протеиназа К — это «незаметный герой» в индустрии молекулярной диагностики, хотя по сравнению с «крупными и влиятельными» игроками отрасли, протеиназа К настолько малоизвестна, что мы долгое время недооценивали её важность. С началом эпидемии коронавируса спрос на протеиназу К резко возрос, а предложение внутри страны и за рубежом значительно отстаёт от потребления, и все внезапно осознали её важность.
Для чего используется протеиназа К?
Протеиназа К — это сериновая протеаза с протеолитической активностью, способная сохранять свою активность в широком диапазоне условий (pH (4-12,5), буфер с высокой концентрацией соли, высокая температура 70 °C и т. д.). Кроме того, активность протеиназы К не ингибируется SDS, мочевиной, ЭДТА, гидрохлоридом гуанидина, изотиоцианатом гуанидина и др., а также определённым количеством детергентов, которые могут усиливать активность протеиназы К. Протеиназа К находит применение в медицине (дезинфекция от вирусов и микроорганизмов), пищевой промышленности (размягчение мяса), кожевенном производстве (смягчение волос), виноделии (осветление спирта), подготовке аминокислот (деградация перьев), экстракции нуклеиновых кислот, гибридизации in situ и др. Наиболее распространённое применение — экстракция нуклеиновых кислот.
Протеиназа К способна ферментативно расщеплять все виды белков в образце, включая гистоны, прочно связанные с нуклеиновыми кислотами, благодаря чему нуклеиновые кислоты высвобождаются из образца и попадают в экстракт, что облегчает следующий этап экстракции и очистки. При обнаружении вирусных нуклеиновых кислот протеиназа К является одним из важных компонентов раствора для отбора проб вируса. Протеиназа К способна расщеплять и инактивировать белок оболочки вируса, что обеспечивает большую безопасность на этапах транспортировки и обнаружения; кроме того, протеиназа К также способна расщеплять РНКазу, предотвращая деградацию вирусной РНК и облегчая обнаружение нуклеиновых кислот.
Бывшая слава протеиназы К
Как в области научных исследований, так и в области диагностики in vitro, экстракция нуклеиновых кислот является наиболее фундаментальным экспериментом, поэтому протеиназа К всегда играла очень важную роль. Однако в прошлом роль протеиназы К была гораздо менее известна. Во многом это объяснялось тем, что соотношение спроса и предложения на протеиназу К было очень стабильным. Мало кто мог предположить, что дефицит протеиназы К может стать проблемой.
С началом эпидемии нового коронавируса резко возрос спрос на тестирование нуклеиновых кислот. По состоянию на конец июня 2020 года в Китае было проведено почти 90 миллионов тестов на новый коронавирус, и эта цифра вызывает еще большую тревогу в глобальном масштабе. В экспериментах по экстракции нуклеиновых кислот рабочая концентрация протеиназы К составляет около 50-200 мкг/мл. Обычно для экстракции образца нуклеиновой кислоты требуется около 100 мкг протеиназы К. На практике, для повышения эффективности экстракции нуклеиновых кислот, часто используется увеличенное количество протеиназы К. Выявление нуклеиновых кислот нового коронавируса привело к значительному росту спроса на протеиназу К. Первоначальный баланс спроса и предложения на протеиназу К быстро нарушился, и протеиназа К в одночасье стала важным средством профилактики эпидемии.
Трудности в производстве протеиназы К.
Несмотря на то, что с развитием эпидемии люди стали больше ценить протеиназу К, вызывает сожаление тот факт, что из-за чрезмерной малоизвестности протеиназы К лишь немногие отечественные компании занимаются её производством. В процессе производства было обнаружено, что протеиназа К — это чрезвычайно специфический белок. Расширение производственных мощностей по выпуску протеиназы К в короткие сроки представляет собой крайне сложную задачу.
Крупномасштабное производство протеиназы К сталкивается со следующими трудностями.
1. Низкий уровень экспрессии
Протеиназа К способна неспецифически расщеплять большинство белков и вызывать серьезную токсичность для клеток-хозяев, в которых она экспрессируется. Поэтому уровень экспрессии протеиназы К обычно очень низок. Для скрининга экспрессионных систем и штаммов, которые высоко экспрессируют протеиназу К, обычно требуется более длительный цикл.
2. Остатки пигментов и нуклеиновых кислот
Крупномасштабная ферментация вносит большое количество пигментов и остатков нуклеиновых кислот хозяина. Удалить эти примеси с помощью простого процесса очистки сложно, а сложная очистка увеличивает стоимость и снижает степень извлечения.
3. Нестабильность
Протеиназа К недостаточно стабильна, она может подвергаться саморазрушению, и ее трудно хранить стабильно при температуре 37°C в течение длительного времени без защитного агента.
4. Легко выпадает в осадок.
При приготовлении лиофилизированного порошка протеиназы К, для обеспечения высокого содержания твердых веществ в порошке, необходимо добавлять лиофилизированный защитный агент в высокой концентрации. Однако, когда концентрация протеиназы К достигает 20 мг/мл и выше, легко происходит агрегация и образование осадка, что создает большие трудности при лиофилизации протеиназы К с высоким содержанием твердых веществ.
5. Крупные инвестиции
Протеиназа К обладает высокой протеазной активностью и способна гидролизовать другие протеазы в лабораторных условиях. Поэтому для исследований, разработок и производства протеиназы К требуются специализированные производственные помещения, оборудование и персонал.
Раствор протеиназы К от XD BIOCHEM
Компания XD BIOCHEM располагает развитой платформой для экспрессии и очистки белков, а также богатым опытом в экспрессии и очистке рекомбинантных белков и оптимизации производственных процессов. Благодаря быстрому формированию научно-исследовательской группы удалось преодолеть трудности крупномасштабного производства протеиназы К. Ежемесячный объем производства лиофилизированного порошка составляет более 30 кг. Продукт обладает стабильными характеристиками, высокой ферментативной специфической активностью и не содержит остатков цитохрома хозяина и нуклеиновых кислот. Обращайтесь в XD BIOCHEM для получения пробного пакета (E-mail:sales@xdbiochem.comТел.: +86 513 81163739).
Технические решения компании XD BIOCHEM включают в себя:
С помощью интеграции многокопийных плазмид были отобраны штаммы с высоким уровнем экспрессии, составляющим 8 г/л, что позволило преодолеть проблему низкого уровня экспрессии протеиназы К.
Благодаря разработке многоступенчатого процесса очистки удалось успешно удалить остатки цитохрома хозяина и нуклеиновой кислоты протеиназы К, снизив их концентрацию ниже стандартного значения.
В результате высокопроизводительного скрининга защитных буферных составов был выбран буфер, способный стабильно хранить протеиназу К при температуре 37°C.
Использование буферных растворов для скрининга позволяет преодолеть проблему, связанную с тем, что протеиназа К легко агрегирует и выпадает в осадок при высоких концентрациях, и закладывает основу для лиофилизации протеиназы К с высоким содержанием твердых веществ.
Образец протеиназы K от XD BIOCHEM
Тест на стабильность протеиназы K от XD BIOCHEM: после 80 дней при комнатной температуре существенных изменений активности не наблюдается.
Тест на стабильность протеиназы K от XD BIOCHEM: после 80 дней при комнатной температуре существенных изменений активности не наблюдается.
Сравнение эффективности экстракции нуклеиновых кислот с помощью протеиназы K XD BIOCHEM и конкурирующих продуктов. В процессе экстракции нуклеиновых кислот используются соответственно протеиназа K XD BIOCHEM и конкурирующая протеиназа K. Эффективность экстракции с помощью протеиназы K XD BIOCHEM выше, а значение Ct целевого гена ниже.
Дата публикации: 31 декабря 2021 г.