IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) — аналог субстрата β-галактозидазы, обладающий высокой индуцируемостью. Под действием IPTG индуктор образует комплекс с белком-репрессором, в результате чего изменяется конформация белка-репрессора, что препятствует его связыванию с целевым геном и обеспечивает эффективную экспрессию целевого гена. Как же следует определять концентрацию IPTG в ходе эксперимента? Чем выше концентрация, тем лучше?
Для начала разберемся в принципе индукции IPTG: лактозный оперон (элемент) E. coli содержит три структурных гена, Z, Y и A, которые кодируют β-галактозидазу, пермеазу и ацетилтрансферазу соответственно. Ген lacZ гидролизует лактозу до глюкозы и галактозы или до аллолактозы; ген lacY позволяет лактозе из окружающей среды проходить через клеточную мембрану и проникать в клетку; ген lacA переносит ацетильную группу от ацетил-КоА к β-галактозиду, что приводит к устранению токсического эффекта. Кроме того, имеется рабочая последовательность O, начальная последовательность P и регуляторный ген I. Ген I кодирует белок-репрессор, который может связываться с позицией O операторной последовательности, так что оперон (мета) подавляется и выключается. Также выше инициирующей последовательности P находится сайт связывания белка-активатора катаболических генов — сайт связывания CAP. Последовательность P, последовательность O и сайт связывания CAP вместе образуют регуляторную область lac-оперона. Кодирующие гены трех ферментов регулируются одной и той же регуляторной областью для достижения скоординированной экспрессии генных продуктов.
В отсутствие лактозы lac-оперон (мета) находится в состоянии репрессии. В это время lac-репрессор, экспрессируемый последовательностью I под контролем последовательности промотора PI, связывается с последовательностью O, что препятствует связыванию РНК-полимеразы с последовательностью P и ингибирует инициацию транскрипции; при наличии лактозы lac-оперон (мета) может быть индуцирован. В этой оперонной (мета) системе реальным индуктором является не сама лактоза. Лактоза проникает в клетку и катализируется β-галактозидазой, превращаясь в аллолактозу. Последняя, как молекула-индуктор, связывается с белком-репрессором и изменяет конформацию белка, что приводит к диссоциации белка-репрессора от последовательности O и транскрипции. Изопропилтиогалактозид (IPTG) оказывает такое же действие, как и аллолактоза. Это очень мощный индуктор, который не метаболизируется бактериями и обладает высокой стабильностью, поэтому широко используется в лабораториях.
Как определить оптимальную концентрацию IPTG? Возьмем в качестве примера кишечную палочку (E. coli).
Генетически модифицированный штамм E. coli BL21, содержащий положительный рекомбинантный pGEX (CGRP/msCT), был инокулирован в жидкую среду LB, содержащую 50 мкг·мл⁻¹ амфотерицина B, и культивировался в течение ночи при 37 °C. Вышеуказанную культуру инокулировали в 10 флаконов по 50 мл свежей жидкой среды LB, содержащей 50 мкг·мл⁻¹ амфотерицина B, в соотношении 1:100 для размножения, и когда значение OD600 достигало 0,6–0,8, добавляли IPTG до конечной концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л⁻¹. После индукции при той же температуре и в течение того же времени из раствора бактерий отбирали 1 мл, бактериальные клетки собирали центрифугированием и подвергали SDS-PAGE анализу влияния различных концентраций IPTG на экспрессию белка, после чего выбирали концентрацию IPTG с наибольшей экспрессией белка.
После экспериментов выясняется, что концентрация IPTG не должна быть максимально высокой. Это связано с тем, что IPTG обладает определенной токсичностью для бактерий. Превышение концентрации также приводит к гибели клеток; и, как правило, мы надеемся, что чем больше растворимого белка экспрессируется в клетке, тем лучше, но во многих случаях при слишком высокой концентрации IPTG образуется большое количество включений в организме, но количество растворимого белка уменьшается. Поэтому наиболее подходящей концентрацией IPTG часто является не чем больше, тем лучше, а чем ниже концентрация.
Целью индукции и культивирования генетически модифицированных штаммов является увеличение выхода целевого белка и снижение затрат. На экспрессию целевого гена влияют не только собственные факторы штамма и экспрессионная плазмида, но и другие внешние условия, такие как концентрация индуктора, температура и время индукции. Поэтому, как правило, перед экспрессией и очисткой неизвестного белка целесообразно изучить время индукции, температуру и концентрацию IPTG, чтобы выбрать подходящие условия и получить наилучшие экспериментальные результаты.
Дата публикации: 31 декабря 2021 г.