Дитиотреитол (ДТТ) — широко используемый восстановитель, также известный как новая «зеленая добавка».Это низкомолекулярное органическое соединение с двумя меркаптановыми группами (-SH).Благодаря своим восстановительным свойствам и стабильности ДТТ широко используется в экспериментах по биохимии и молекулярной биологии.
Основная роль ДТТ заключается в восстановлении дисульфидных связей в белках и других биомолекулах.Дисульфидная связь является важной частью сворачивания и стабильности белка, но в определенных экспериментальных условиях, таких как анализ SDS-PAGE, рекомбинация и сворачивание белка, необходимо восстановить дисульфидную связь до двух тиоловых групп, чтобы разгадать пространственную структуру белок.ДТТ может реагировать с дисульфидными связями, восстанавливая их до меркаптановых групп, тем самым открывая пространственную структуру белка и упрощая его анализ и манипулирование.
DTT также можно использовать для защиты активности и стабильности ферментов.В некоторых реакциях, катализируемых ферментами, активность фермента может снижаться под действием окислителя.ДТТ может вступать в реакцию с окислителями, восстанавливая их до безвредных веществ, тем самым защищая активность и стабильность фермента.
По сравнению с традиционными восстановителями, такими как β-меркаптоэтанол (β-ME), DTT считается более безопасным и стабильным восстановителем.Он не только стабилен в водном растворе, но также сохраняет свои восстановительные свойства при высоких температурах и кислотно-щелочных условиях.
Использование DTT относительно просто.Обычно ДТТ растворяют в соответствующем буфере, а затем добавляют в экспериментальную систему.Оптимальную концентрацию ДТТ необходимо определять в соответствии с конкретным экспериментом, и обычно она используется в диапазоне 0,1–1 мМ.Более низкие концентрации могут уменьшить неблагоприятное воздействие на рост клеток и снизить цитотоксичность из-за сверхэкспрессии белков-мишеней.Более высокие концентрации могут вызвать чрезмерную метаболическую нагрузку на клетки, влияя на рост клеток и эффективность экспрессии.
Способом определения оптимальной концентрации может быть оценка уровня экспрессии целевого белка путем проведения тестов индукции IPTG при различных концентрациях.Небольшие культуральные тесты можно проводить с использованием диапазона концентраций IPTG (например, 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ и т. д.), а эффект экспрессии при различных концентрациях можно оценить путем определения уровня экспрессии целевого белка (например, Western блоттинг или флуоресцентное детектирование).По результатам эксперимента в качестве оптимальной концентрации была выбрана концентрация с наилучшим эффектом экспрессии.
Кроме того, вы также можете обратиться к соответствующей литературе или опыту других лабораторий, чтобы понять обычно используемый диапазон концентраций IPTG в аналогичных экспериментальных условиях, а затем оптимизировать и отрегулировать их в соответствии с экспериментальными потребностями.
Важно отметить, что оптимальная концентрация может варьироваться в зависимости от различных систем экспрессии, целевых белков и условий эксперимента, поэтому лучше всего оптимизировать ее в каждом конкретном случае.
Таким образом, ДТТ является широко используемым восстановителем, который можно использовать для восстановления дисульфидных связей в белках и других биомолекулах, а также для защиты активности и стабильности ферментов.Он широко использовался в экспериментах по биохимии и молекулярной биологии.
Время публикации: 28 сентября 2023 г.